Mutacje somatyczne w genie Connexin 40 (GJA5) w migotaniu przedsionków cd

Klony sekwencjonowano w celu potwierdzenia mutacji i wykluczono wszelkie inne warianty sekwencji. W eksperymentach lokalizacyjnych, dzikiego typu i zmutowanego GJA5 znakowano białkiem zielonej fluorescencji (GFP). GDD znakowany GFP typu dzikiego lub zmutowany cDNA GJA5 transfekowano do komórek nerwiaka niedojrzałego (N2A), linii komórkowej z niedoborem połączeń z przerwami. Koneksyna 40 wyrażana w transfekowanych komórkach N2A była immunolabelowana rozcieńczeniem 1: 100 przeciwciała anty-connexin 40 (Chemicon), a następnie anty-IgG sprzężonym z Texas Red (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Komórki oglądano za pomocą mikroskopii konfokalnej. Analiza immunohistochemiczna
Analizę immunohistochemiczną wykonano na skrawkach (o grubości 7 .m) przedsionkowej tkanki serca utrwalonej w formalinie i zatopionej w parafinie. Skrawki tkanki poddano deparafinizacji, a antygeny odzyskano przez umieszczenie ich w kuchence mikrofalowej na 12,5 minuty w buforze cytrynianowym (pH 5,6). Próbki następnie zablokowano w 1:20 normalnej surowicy końskiej i inkubowano z 1: 100 przeciwciałem anty-connexin 40. Pierwotne przeciwciało zostało następnie wykryte za pomocą układu chromagenowego diaminobenzydyny (Dako).
Eksperymenty elektrofizjologiczne
Aby ocenić funkcję białka, wybraliśmy pary komórek N2A z widocznymi łysinkami w złączeniu komórka-komórka. Podwójne zapisy napięcia na zaciskach całych komórek przeprowadzono w temperaturze pokojowej. Aby zasymulować efekt heterozygotyczności i ocenić wpływ zmutowanego białka koneksyny 40 na inne koneksyny sercowe, wstrzyknęliśmy oocyty z rodzaju Xenopus komplementarnym RNA (cRNA) dla koneksyny 40 typu dzikiego, koneksyny dzikiego typu 43, zmutowanej koneksyny 40 lub mieszanina cRNA connexin 40 typu dzikiego i zmutowanego w stosunku 1: 1, jak opisano wcześniej.
Analiza statystyczna
Zastosowaliśmy dokładny test Fishera do analizy różnic w częstości zmian sekwencji kodujących między próbkami od pacjentów z migotaniem przedsionków a próbkami od kontroli.
Wyniki
Mutacje
Tabela 1. Tabela 1. Charakterystyka kliniczna pacjentów z idiopatycznym migotaniem przedsionków i stanem mutacji Connexin 40. Rycina 1. Rycina 1. Wykryte podstawienia w koneksinie 40 u pacjentów z idiopatycznym migotaniem przedsionków. Panel A ilustruje lokalizacje wykrytych podstawień w koneksinie 40, wszystkie przewidywane w obrębie regionów obejmujących transmembranę. Gly38 (reprezentowany przez G) znajduje się wewnątrz pierwszej domeny transbłonowej (TM1), Pro88 (P) i Ala96 (A) w TM2 i Met163 (M) w TM3. Wyniki analizy sekwencji (Panel B, lewa strona) pokazują wykrycie substytucji Pro88 . Ser w tkance serca, ale nie tkance limfocytowej, co wskazuje na somatyczne źródło mutacji w GJA5. Subklonowanie lewych przedsionkowych alleli i trawienie enzymem restrykcyjnym za pomocą HypCH4 IV uwolniło przewidywany fragment 331-bp wytworzony przez mutację (panel B, środkowy i prawy bok). Panele C i D pokazują wyniki sekwencjonowania i subklonowania alleli dla substytucji somatycznych Met163 . Val i Gly38 . Asp, odpowiednio, które były również obecne w tkance sercowej, ale nie tkance limfocytowej. Panel E pokazuje zmianę sekwencji Ala96 . Ser, która była jedynym wariantem wykrywanym w tkance limfocytowej od pacjenta
[więcej w: jąkanie wczesnodziecięce, stomatolog na nfz lublin, mini implanty ]
[przypisy: uchyłek zenkera, poziomka oświęcim, rejs rypin ]