Panel A pokazuje poziomy ROS, oceniane jako średnie (. SE) intensywność fluorescencji 2 , 7 -dichlorofluoresceiny (DCF), w normalnych ludzkich fibroblastach inkubowanych z IgG z trzech normalnych kontroli (N) i IgG od trzech pacjentów z twardzina układowa (SSc) (przy 200 .g na mililitr na 15 minut) i wstępnie inkubowana z selektywnymi inhibitorami receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) i PDGFR (AG 1478 i AG 1296, odpowiednio, 2 .M przez dwie godziny) i FTI-277 (20 .M przez dwie godziny) i PD 98059 (40 .M przez dwie godziny). FCS oznacza surowicę płodową. Panel B przedstawia fluorescencyjne obrazy mikroskopowe i immunoprecypitacyjne immunobloty białka Ha-Ras w normalnych ludzkich fibroblastach inkubowanych z normalnymi (N) i twardziną (SSc) IgG (200 ug na mililitr przez 15 minut) w obecności i przy braku selektywnych inhibitorów (AG 1478). i AG 1296, 2 .M przez dwie godziny). Niewielkie zahamowanie pasma Ha-Ras przez AG 1478 było zależne od wysokiego stężenia stosowanego w tym konkretnym eksperymencie (stężenie hamujące EGFR o stężeniu 50%, 3 nM). Przedstawiono reprezentatywne wyniki jednego z pięciu eksperymentów. NIS oznacza surowicę nieimmunologiczną, a pKK1 / 2 fosforylowane ERK1 / 2. Jak pokazano w Tablicy C, lizaty komórkowe poddano immunoprecypitacji za pomocą IgG oczyszczonej z dwóch zdrowych kontrolnych (N), dwóch pacjentów z twardziną układową (SSc) i jednego pacjenta z układowym toczniem rumieniowatym (SLE) i rozwiniętych za pomocą swoistych przeciwciał przeciwko PDGFR i EGFR ( za pomocą techniki immunoblot). Pierwsze dwa pasma po lewej to immunobloty wszystkich białek wyekstrahowanych z twardziny lub prawidłowych fibroblastów i sondowane przeciwciałami przeciw PDGFR i EGFR. Przedstawiono reprezentatywne wyniki jednego z trzech eksperymentów. Jak pokazano w Tablicy D, normalne ludzkie fibroblasty stymulowano za pomocą twardziny (SSc) IgG (100, 200 i 300 .g na mililitr przez 15 minut) lub PDGF (15 ng na mililitr przez 15 minut) lub hodowano na 0,2 procent płodu łydkowego serum. Lizaty komórkowe poddano immunoprecypitacji za pomocą przeciwciała poliklonalnego przeciwko PDGFR (podjednostka .), a immunobloty opracowano z użyciem swoistego przeciwciała przeciw fosforylowanej tyrozynie (pTyr). Aby przeanalizować kaskadę sygnalizacyjną wywołaną przez sklerodermalną IgG, przeanalizowaliśmy aktywność IgE wytwarzającą ROS u trzech pacjentów ze sklerodermą w porównaniu z trzema normalnymi kontrolami w obecności specyficznych inhibitorów: inhibitorów sygnalizacji EGFR i PDGFR (AG 1478 i AG 1296, odpowiednio); FTI-277, inhibitor farnezylotransferazy, enzym wymagany do przyłączenia Ras do błony komórkowej; i inhibitor MEK, PD 98059, który jest kinazą znajdującą się przed ERK1 / 2. Figura 3A pokazuje, że inhibitory PDGFR (nie EGFR), Ras i MEK zapobiegały indukcji ROS przez twardzinę skóry twG w prawidłowych fibroblastach (P <0,001 dla porównania z samą twardziną stwardniałą IgG). Inną cechą aktywacji PDGFR jest stabilizacja białka Ha-Ras. Niedawno odkryliśmy, że poziomy białka Ha-Ras są regulowane przez PDGF, ROS i ERK1 / 2 i że niskie poziomy są utrzymywane przez degradację proteasomu.8 Stężone Ha-Ras stymulowane stward-nie IgG, i ten wzrost został zniesiony przez hamowanie PDGFR, jak wykazano. metodą immunofluorescencji i analizy immunoblot (Figura 3B) [hasła pokrewne: stomatolog na nfz lublin, gabinet psychoterapii szczecin, mrt test ] [patrz też: cezal kraków, koam skoczów, lutinus cena ]