Stymulujące autoprzeciwciała wobec receptora PDGF w twardzinie układowej czesc 4

Jak pokazano w Tablicy B, lizaty F., F i F – / – poddano immunoprecypitacji z IgG oczyszczonym od pacjentów z twardziną układową iz kontroli. Filtry zostały opracowane za pomocą specyficznych przeciwciał przeciwko podjednostkom . i . PDGFR przy użyciu techniki immunoblot. Całkowity lizat oznacza immunobloty wszystkich białek. Przedstawiono reprezentatywne wyniki jednego z trzech eksperymentów. Jak pokazano w Tablicy C, IgG od pacjentów z twardziną układową (200 .g na mililitr) inkubowano z 200 .g całkowitego lizatu komórek F. przez cztery godziny. Mieszaninę poddano immunoprecypitacji za pomocą białka AG sepharose i peletki (P) opracowanej ze specyficznymi przeciwciałami przeciw łańcuchowi . PDGFR. W celu wykazania, że przeciwciała anty-PDGFR nie występują w supernatancie (Sup), rekombinowaną zewnątrzkomórkową domenę łańcucha . PDGFR zmieszano z supernatantem i poddano immunoprecypitacji z białkiem AG sepharose. Tę samą procedurę przeprowadzono z komórkami F – / -. Przedstawiono reprezentatywne wyniki jednego z trzech eksperymentów. Jak pokazano w Tablicy D, IgG od pacjentów z twardziną układową lub PDGF preinkubowano przez 30 minut w 37 ° C z 0,5, 5,0 i 50,0 .g rekombinowanego PDGFR, a następnie inkubowano z komórkami F.. Podano względną aktywność indukującą ROS (wyrażoną fluorescencją dioctanu 2 , 7 -dichlorofluoresceiny [DCF]). Eksperyment powtórzono dwukrotnie. T bary reprezentują SE. Figura 1A wskazuje, że poziomy ROS indukowane przez IgG od pacjentów ze sklerodermą (w stężeniu 200 .g na mililitr przez 15 minut na 20 000 komórek), wyrażone jako wskaźnik stymulacji (mediana, 0,86, zakres, od 0,31 do 3,82) były znacząco wyższe. wyższe niż poziomy ROS wytwarzane przez normalne IgG (mediana, 0, zakres 0 do 0,02) lub IgG od pacjentów z pierwotnym objawem Raynauda (mediana, 0; zakres, 0 do 0,19), toczeń rumieniowaty układowy (mediana, 0; 0 do 0,22), reumatoidalne zapalenie stawów (mediana, 0; zakres, 0 do 0,13) lub śródmiąższowa choroba płuc (mediana, 0; zakres, 0 do 0,17) (p <0,001 dla wszystkich porównań). Wykorzystując 99. percentyl jako górną granicę normy, przeciwciała stymulujące wytwarzanie ROS znaleziono u wszystkich pacjentów ze sklerodermią iu żadnej z kontroli (Figura 1A).
Aby udowodnić, że aktywność indukująca ROS była pośredniczona przez aktywację PDGFR, przeprowadziliśmy kilka dodatkowych eksperymentów. Po pierwsze, akumulacja ROS indukowana w komórkach F. eksponowanych na twardzinę twardzinową została zahamowana przez wstępną inkubację komórek z inhibitorem kinazy tyrozynowej PDGFR AG 1296 (Figura 1A). Sklerodermalna IgG nie stymulowała ROS w komórkach F – / – (Figura 1A). Ponadto, sklerodermalna IgG, a nie IgG z kontroli, immunoprecypitowała podjednostki . i . PDGFR (Figura 1B). Przeciwciała oddziałujące PDGFR w sklerodermalnej IgG zostały całkowicie usunięte przez preabsorpcję komórkami F., ale nie komórkami F – / – (Figura 1C). Ponadto supernatant po absorpcji z komórkami F. nie stymulował wytwarzania ROS (dane nie przedstawione). Odwrotnie, gdy IgG od pacjentów ze sklerodermą inkubowano z komórkami F – / -, przeciwciała oddziałujące PDGFR nie zostały usunięte (Figura 1C). Rekombinowany receptor PDGFR, wstępnie inkubowany ze sklerodermalną IgG, hamował jego aktywność indukującą ROS całkowicie i w sposób zależny od dawki (Figura 1D).
Rysunek 2
[przypisy: jak namówić alkoholika na leczenie, siłownie plenerowe, mrt test ]
[hasła pokrewne: mrt test, piramida zdrowia lublin, optium xido ]